Структура и химический состав
Вирус гриппа имеет сферическую форму, диаметром 80-120 нм. Реже встречаются нитевидные формы. Нуклеокапсид спиральной симметрии представляет собой рибонуклеопротеиновый (РНП) тяж, уложенный в виде двойной спирали, которая составляет сердцевину вириона. С ней связаны РНК-полимераза и эндонуклеазы (Р1 и РЗ). Сердцевина окружена мембраной, состоящей из белка М, который соединяет РНП с двойным липидным слоем внешней оболочки и шиловидными отростками, состоящими из гемагглютинина и нейраминидазы.Вирионы содержат около 1% РНК, 70% белка, 24% липидов и 5% углеводов. Липиды и углеводы входят в состав липопротеидов и гликопротеидов внешней оболочки и имеют клеточное происхождение. Геном вируса представлен минус-нитевой фрагментированной молекулой РНК. Вирусы гриппа типов А и В имеют 8 фрагментов РНК Из них 5 кодируют по одному белку, а 3 последних - по два белка каждый.Антигены
Вирусы гриппа А, В и С отличаются друг от друга по типоспецифическому антигену, связанному с РНП (белок NP) и М-матриксным белком, стабилизирующим структуру вириона Этиантигены выявляются в РСК. Более узкую специфичность вируса типа А определяют два других поверхностных антигена - гемагглютинин Н и нейраминидаза N, обозначаемые порядковыми номерами.Гемагглютинин является сложным гликопротеином, обладающим протективными свойствами. Он индуцирует в организме образование вируснейтрализующих антител - антигемагглютининов, выявляемых в РТГА. Изменчивость гемагглютинина (Н-антигена) определяет антигенный дрейф и шифт вируса гриппа. Под антигенным дрейфом понимают незначительные изменения Н-антигена, вызванные точечными мутациями в гене, контролирующем его образование. Подобные изменения могут накапливаться в потомстве под влиянием таких селективных факторов, как антитела. Это в конечном итоге приводит к количественному сдвигу, выражающемуся в изменении антигенных свойств гемагглютинина. При антигенном шифте происходит полная замена гена, в основе которой, возможно, лежат рекомбинации между двумя вирусами. Это приводит к смене подтипа гемагглютинина или нейраминидазы, а иногда обоих антигенов, и появлению принципиально новых антигенных вариантов вируса, вызывающих крупные эпидемии и пандемии.Гемагглютинин является также рецептором, с помощью которого вирус адсорбируется на чувствительных клетках, в том числе эритроцитах, вызывая их склеивание, и участвует в гемолизе эритроцитов.Вирусная нейраминидаза - фермент, катализирующий отщепление сиаловой кислоты от субстрата. Она обладает антигенными свойствами и в то же время участвует в освобождении вирионов из клетки хозяина. Нейраминидаза, подобно гемагглютинину, изменяется в результате антигенного дрейфа и шифта.Культивирование и репродукция
Вирусы гриппа культивируются в куриных эмбрионах и в культурах клеток. Оптимальной средой являются куриные эмбрионы, в амниотической и аллантоисной полостях которых вирус репродуцируется в течение 36-48 ч. Наиболее чувствительными к вирусу гриппа являются первичные культуры клеток почек эмбриона человека и некоторых животных. Репродукция вируса в этих культурах сопровождается слабовыраженным ЦПД, напоминающим спонтанную дегенерацию клеток. Вирусы гриппа адсорбируются на гликопротеиновых рецепторах эпителиальных клеток, в которые они проникают путем рецепторно-го эндоцитоза. В ядре клетки происходит транскрипция и репликация вирусного генома. При этом считываемые отдельные фрагменты РНК в виде м-РНК транслируются на рибосомы, где происходит синтез вирусоспецифических белков. После репликации вирусного генома формируется фонд вирусных РНК, который используется при сборке новых нуклеокапсидов.Патогенез
Первичная репродукция вируса происходит в эпителиальных клетках дыхательных путей. Через эрозированную поверхность слизистой оболочки вирус попадает в кровь, вызывая вирусемию. Циркуляция вируса в крови сопровождается повреждением эндотелиальных клеток кровеносных капилляров, в результате чего повышается их проницаемость. В тяжелых случаях наблюдаются кровоизлияния в легкие, сердечную мышцу и другие внутренние органы. Вирусы гриппа, попадая в лимфатические узлы, повреждают лимфоциты, следствием чего является приобретенный иммунодефицит, который способствует возникновению вторичных бактериальных инфекций.При гриппе имеет место интоксикация организма различной степени тяжести.Иммунитет
Механизм противогриппозного иммунитета связан с естественными факторами противовирусной неспецифической защиты, главным образом с продукцией интерферона и натуральными клетками-киллерами.Специфический иммунитет обеспечивается факторами клеточного и гуморального ответа. Первые представлены макрофагами и Т-киллерами. Вторые - иммуноглобулинами, прежде всего антигемагглютининами и антинейроминидазными антителами, обладающими вируснейтрализующими свойствами. Последние в отличие от антигемагглютининов только частично нейтрализуют вирус гриппа, препятствуя его распространению. Комплементсвязывающие антитела к вирусному нуклеопротеину не обладают протективными свойствами и через 1,5 мес. исчезают из крови реконвалесцентов.Антитела обнаруживаются в сыворотке крови через 3-4 суток после начала заболевания и достигают максимальных титров через 2-3 недели. Продолжительность специфического иммунитета, приобретенного после гриппозной инфекции, вопреки прежним представлениям, измеряется несколькими десятилетиями. К этому заключению пришли на основании изучения возрастной структуры заболеваемости гриппом, вызванным вирусом A (H1N1) в 1977 г. Было установлено, что данный вирус, отсутствовавший с 1957 г., поражал в 1977 г. только лиц не старше 20 лет.Таким образом, после перенесения гриппозной инфекции, вызванной вирусом гриппа типа А, формируется напряженный иммунитет, строго специфический к тому подтипу вируса (по Н- и N-антигенам), который вызвал его образование.Кроме того, новорожденные обладают пассивным иммунитетом, обусловленным антителами класса IgG к соответствующему подтипу вируса А. Иммунитет сохраняется в течение 6-8 мес.Эпидемиология
Источником инфекции являются больные люди и вирусоносители. Передача возбудителя происходит воздушно-капельным путем. Грипп относится к эпидемическим инфекциям, которыечаще возникают в зимние и зимне-весенние месяцы. Примерно через каждые десять лет эпидемии гриппа принимают характер пандемий, охватывающих население разных континентов. Это объясняется сменой Н- и N-антигенов вируса типа А, связанного с антигенным дрейфом и шифтом. Например, вирус гриппа А с гемагглютинином NSW1 вызвал в 1918 г. пандемию «испанки», унесшей 20 млн. человеческих жизней. В 1957 г. «азиатский» вирус гриппа (H2N2) вызвал пандемию, охватившую более 2 млрд. человек. В 1968 г. появился новый пандемический вариант - вирус гриппа A (H3N2), получивший название «гонконгский», который продолжает циркулировать до настоящего времени. В 1977 г. к нему присоединился вирус типа A (H1N1).Это оказалось неожиданным, поскольку идентичный вирус уже циркулировал в 1947-1957 гг., а затем был полностью вытеснен «азиатским» подтипом. В этой связи возникла гипотеза о том, что шифтовые варианты вируса не являются исторически новыми. Они представляют собой циркулирующие в прошедшие годы сероподтипы.Прекращение циркуляции вируса гриппа, вызвавшего очередную эпидемию, объясняется коллективным иммунитетом населения, сформировавшимся к данному антигенному варианту возбудителя. На этом фоне происходит селекция новых антигенных вариантов, коллективный иммунитет к которым еще не сформировался.Пока неясно, где сохраняются в течение длительного времени шифтовые антигенные варианты (сероподтипы) вируса гриппа типа А, вышедшие из активной циркуляции в тот или иной исторический период. Возможно, что резервуаром сохранения таких вирусов являются дикие и домашние животные, особенно птицы, которые инфицируются человеческими вариантами гриппозных вирусов типа А и поддерживают их циркуляцию в течение длительного времени. При этом в организме птиц происходят генетические рекомбинации между птичьими и человеческими вирусами, которые приводят к формированию новых антигенных вариантов.По другой гипотезе вирусы гриппа всех известных подтипов постоянно циркулируют среди населения, но становятся эпидемически актуальными лишь при снижении коллективного иммунитета.Вирусы гриппа типов В и С отличаются более высокой антигенной стабильностью. Вирусы гриппа типа В вызывают менее интенсивные эпидемии и локальные вспышки. Вирус гриппа типа С является причиной спорадических заболеваний.Вирус гриппа быстро разрушается под действием температуры выше 56°С, УФ-излучения, дезинфектантов, детергентов. Он сохраняет свою жизнеспособность в течение 1 сут. при комнатной температуре, на гладких металлических и пластмассовых поверхностях - до 2-х сут. Вирусы гриппа сохраняются при низких температурах (-70°С).Специфическая профилактика
Для профилактики гриппа используют ремантадин, который подавляет репродукцию вируса гриппа типа А. Для пассивной профилактики применяют противогриппозный иммуноглобулин человека, полученный из сыворотки крови доноров, иммунизированных гриппозной вакциной. Определенный эффект оказывает человеческий лейкоцитарный интерферон.Для вакцинопрофилактики используют живые и инактивированные вакцины. При введении живых вакцин формируется как общий, так и местный иммунитет. Кроме того, отмечается индукция интерферона.В настоящее время получены инактивированные вакцины различных типов: вирионные, субъединичные, расщепленные и смешанные. Вирионные вакцины получают путем высококачественной очистки вирусов, выращенных в куриных эмбрионах. Субъединичные вакцины представляют собой очищенные поверхностные антигены вируса гриппа - гемагглютинины и нейраминидазу. Такие вакцинные препараты характеризуются пониженной реактогенностью и высокой иммуногенностью. Расщепленные или дезинтегрированные вакцины получают из очищенной суспензии вирионов путем обработки детергентами. Однако пока еще отсутствует единое мнение о преимуществе какой-либо одной из этих вакцин. Инактивированные вакцины индуцируют иммунный ответ в системе общего и местного гуморального иммунитета, но в меньшей степени по сравнению с живыми вакцинами индуцируют синтез интерферона.Многолетний опыт применения живых и инактивированных вакцин свидетельствует о том, что антигенное несоответствие вакцинных штаммов эпидемическим служит основной, но не единственной причиной низкой эффективности вакцинопрофилактики гриппа. В последние годы предпринимаются попытки создания генноинже--нерных и синтетических гриппозных вакцин.Грипп
Грипп - острое респираторное заболевание человека, которое имеет тенденцию к эпидемическому распространению. Характеризуется катаральным воспалением верхних дыхательных путей, лихорадкой, выраженной общей интоксикацией. Часто грипп сопровождается возникновением тяжелых осложнений - вторичных бактериальных пневмоний, обострением хронических заболеваний легких.Возбудители гриппа относятся к семейству Orthomyxoviridae. Она включает три рода вирусов - А, В, С.Вирус гриппа имеет сферическую форму, его размеры 80-120 нм. Порой образуются нитевидные вирионы. Геном образован однониточной минус-нитью РНК, которая состоит из восьми фрагментов, и окружен белковым капсидом. РНК ассоциированная с 4 внутренними белками: нуклеопротеидов (NP) ивысокомолекулярными белками PI, Р2, РЗ, участвующих в транскрипции генома и репликации вируса. Нуклеокапсид имеет спиральный тип симметрии. Над капсидного оболочкой находится слой матриксного белка (М протеин). На внешней, суперкапсидний оболочке в виде шипиков расположены гемагглютинин (Н) и нейраминидаза (N). Оба гликопротеины (N и Н) имеют выраженные антигенные свойства. У вирусов гриппа найдено 13 различных антигенных типов гемагглютинина (НИ-13) и 10 вариантов нейраминидазы (N1-10).По внутреннему нуклеопротеидный антигеном различают три типа вирусов гриппа - А, В, С, которые можно определить в РСК. У вирусов типа А, которые поражают человека есть три вида гемагглютинина (HI, Н2, НЗ) и две - нейраминидазы (N1, N2). Зависимости от их комбинаций, выделяют варианты вирусов гриппа А - H1N1, H2N2, H3N2. их определяют в реакции торможения гемагглютинации с соответствующими сыворотками.Вирусы гриппа легко культивируются в куриных эмбрионах и различных культурах клеток. Максимальное накопление вирусов происходит через 2-3 дня. Во внешней среде вирус быстро теряет инфекционность через высушивания. При низкой температуре в холодильнике хранится в течение недели, при -70 ° С - значительно дольше. Нагрев приводит к его инактивации через несколько минут. Под влиянием эфира, фенола, формалина быстро разрушается.Вирусологический метод диагностики
Материалом для исследования смывы из носоглотки, выделения из носа, которые принимают сухими или влажными стерильными ватными тампонами в первые дни заболевания, мокроты. Вирусы можно обнаружить в крови, спинномозговой жидкости. При летальных случаях забирают кусочки пораженных тканей верхних и нижних дыхательных путей, головного мозга и т.п..Носоглоточные смывы берут натощак. Больной должен трижды прополоскать горло стерильным физиологическим раствором хлорида натрия (10-15 мл), который собирают в стерильную банку с широким горлом. После этого кусочком стерильной ваты протирают заднюю стенку глотки, носовые ходы, затем ее окунают в банку со смывом.Можно взять материал стерильным, увлажненным в растворе хлорида натрия тампоном, которым тщательно протирают заднюю стенку глотки. После забора материала тампон погружают в пробирку с физиологическим раствором, к которому добавлено 5% инактивированной сыворотки животных. В лаборатории тампоны полощут в жидкости, отжимают у стенки пробирки и удаляют. Слив выдерживают в холодильнике для отстаивания, затем отбирают среднюю часть жидкости в стерильные пробирки. К материалу добавляют антибиотики пенициллин (200-1000 ЕД / мл), стрептомицин (200-500 мкг / мл), нистатин (100-1000 ЕД / мл) для уничтожения сопутствующей микрофлоры, выдерживают 30 мин при комнатной температуре и используют для выделения вирусов, предварительно проверив его на стерильность.Чувствительным методом выделения вирусов заражения 10-11-дневных куриных эмбрионов. Материал в объеме 0,1-0,2 мл вводят в амниотическую или аллантоиса полости. Заражают, как правило, 3-5 эмбрионов. Эмбрионы инкубируют при оптимальной температуре 33-34 ° С в течение 72 часов. С целью увеличения количества вирионов в исследуемом материале его предварительно концентрируют. Для этого используют методы адсорбции вирусов на куриных эритроцитах, обработку 0,2% раствором трипсина с целью усиления инфекционных свойств вирусов или осаждают их по специальным методикам.После инкубации куриные эмбрионы охлаждают при температуре 4 ° С в течение 2-4 ч, затем отсасывают стерильными пипетками или шприцем алантоисну или амниотическую жидкость. В этой с помощью РГА определяют наличие инфекционного вируса. Для этого смешивают равные объемы (0,2 мл) вирусмисткого материала и 1% взвеси эритроцитов кур. О положительной реакции (наличие вируса в материале) свидетельствует оседания эритроцитов в виде зонтика.При наличии в материале вируса, который имеет гемаглютинуючи свойства, его титруют с помощью развернутой РГА, определяя титр гемаглютинуючои активности.С помощью этой реакции определяют титр гемаглютинуючого вируса - наибольшее разведение материала, которое еще дает реакцию гемагглютинации. Это количество вируса принимают за одну гемаглютинуючу единицу (ГАО).Идентифицируют вирусы гриппа с помощью РТГА
Для этого сначала готовят рабочее разведение вирусного материала, которое содержит 4 ГАО вируса в определенном объеме.Учет реакции проводят после образования осадка эритроцитов в контрольных лунках. О положительной реакции свидетельствует задержка гемагглютинации в исследуемых лунках.Выделять вирусы гриппа можно, используя различные линии культур клеток - эмбриона человека, почек обезьян, перевиваемой линии клеток почек собаки (MDCK) и другие. В клеточных культурах проявляется цитопатическое действие вирусов (появление клеток с фестончатыми краями, вакуолями, формирование внутриядерных и цитоплазматических включений), которая завершается дегенерацией монослоя клеток.Для идентификации выделенных вирусов используют РТГА (при условии, если тите гемагглютинина составляет в культу рал ьний жидкости не менее 1:8). Кроме этой реакции можно использовать РГГадс, однако она менее чувствительна и требует титра иммунной сыворотки не менее 1:160 а также РСК, РН, РЕМА подобное.Серологическое исследование
Серологическое исследование используют для подтверждения диагноза гриппа. Оно основывается на определении четырехкратного роста титра антител в сыворотке больного.Первую сыворотку получают в начале болезни в остром периоде (2-5-1 день болезни), вторую - после 10-14-го дня заболевания. Поскольку сыворотки дослтн джують одновременно, первую из них хранят в холодильнике при температуре -20 ° С. Чаще всего используют РТГА, РСК, РНГА. Эти реакции ставят со специальными наборами стандартных вирусных диагностикумов (эталонные штаммы вируса гриппа различных серологических типов). Поскольку сыворотки больных могут содержать неспецифические ингибиторы гемагглютинации, их сначала прогревают при температуре 56 ° С, а также обрабатывают специальным ферментом (например, нейраминидая зой) или растворами перйодаты калия, риванола, хлорида Марганца, суспензиеы белой шины т.п. по специальным схемам. ИРеакция торможения гемагглютинации
Реакцию торможения гемагглютинации можно ставить в пробирках (макромш тод) или в специальных планшетах для иммунологических исследований.Реакция считается положительной при образовании компактного, плотного осадка эритроцитов с ровными краями.Экспресс-диагностика
Метод основан на выявлении в исследуемом материале специфических вирусных антигенов с помощью иммунофлюоресценции в прямой или косвенной РИФ. Слизь получают из носовых ходов или задней стенки глотки, центрифугируют и из осадка клеток цилиндрического эпителия слизистой оболочки готовят мазки на предметных стеклах. их обрабатывают иммунофлуоресцентный сыворотками, конъюгированными с флуорохромами, например, ФИТЦ (флуоресцеинизотиоцианат). При исследовании препаратов с помощью люминесцентного микроскопа наблюдают характерное зелено-желтое свечение вирусов гриппа, которые локализуются в начале болезни в ядрах эпителиальных клеток.В последнее время предлагается использовать для индикации специфических вирусных антигенов ИФА, РЗНГА, ПЦР.Адсорбция
Знаменитое «H5N1» расшифровывается как «гемагглютинин пятого типа, нейраминидаза первого типа» - эти два белка торчат на поверхности вируса гриппа (на рис. 1 гемагглютинин зелененький, а нейраминидаза серенькая).
С помощью гемагглютинина вирус гриппа присоединяется к рецепторам на поверхности клеток. Изначальная цель вируса - клетки ресничного эпителия дыхательных путей, но любим мы его не за это: гемагглютинин может присоединяться к рецепторам многих других клеток, в том числе - эритроцитов. Если один вирус присоединится к двум (соседним) эритроцитам одновременно, то эритроциты склеятся! Отсюда и название белка - «крово-склеивающий».
рис. 1
Внедрение
Дура-клетка поглощает присоединившийся к ней вирус путем фагоцитоза - типа, ест его. Ну почему, почему дети всегда тянут в рот всякую гадость?! Впрочем, вирус оказывается внутри клетки пока что на правах еды, внутри фагоцитозного пузырька (на рис. 2 - «endosome»). Эндосома сливается с лизосомой, получается пищеварительная вакуоль, в нее из цитоплазмы закачиваются протоны для создания кислой среды (этот процесс показан на рис. 2) - еще чуть-чуть, и мы переварим вирус (со словами «белковая пища, какая разница»).
рис. 2
Раздевание
Но вирус готов к такому повороту событий:
 рис. 3 |
- Гемагглютинин под действием кислой среды видоизменяется - его поверхность становится гидрофильной, и он (до этого присоединенный к рецептору на внутренней поверхности мембраны эндосомы, теперь) внедряется внутрь этой мембраны.
- Протоны, закачанные в эндосому, проходят сквозь специальные белки-каналы (белки М2, обозначены на рис. 1 и рис. 3) через липидную оболочку вируса и добираются до белковой оболочки вируса (на рис. 1 - кружочек из белых шариков - белков М1). Белковая оболочка из-за этого разрушается (на рис. 3 белки М1 разрушевшейся белковой оболочки обозначены как красные звёздочки).
- Липидная оболочка вируса (за счет проникающего действия гемагглютинина) сливается с (липидной) мембраной фагосомы; РНК вируса оказывается в цитоплазме клетки.
Репликация вируса
РНК вируса, вышедшая в цитоплазму, сама по себе совершенно безопасна.
- Белки на ней делать нельзя, потому что это минус-РНК (белки кодирует не она, а комплементарная ей плюс-цепь, которой пока что еще нет).
- РНК на ней делать тоже нельзя - в наших клетках вообще нет фермента, способного удваивать РНК.
«О-хо-хо, ничего-то у вас нет», - покачивая усатой головой, ворчит вирус гриппа, «но ничего, я принес все с собой». С собой вирус принес белки PB1, PB2 и PA, которые вместе образуют вирусную РНК-зависимую РНК-полимеразу - она может удваивать РНК. Но вот незадача! Любой полимеразе для начала работы нужен праймер, а его-то забывчивый грипп с собой и не захватил! Всё кончено?!
Спокойно, без паники! - С такими словами вся компания (8 вирусных РНК и 3 вирусных фермента) отправляется в ядро клетки. Там грипп получает полное обслуживание:
- праймерами для репликации вирусной РНК (для получения плюс-РНК) служат участки, отщепленные от клеточных РНК;
- процессинг: участки, которые служили праймерами для синтеза РНК - это были кэпы, так что модификация 5"-конца, считай, была проведена в самом начале; в конце синтеза происходит полиаденирование 3"-конца;
- сплайсинг: некоторые РНК вируса, содержащие информацию о двух белках, разрезаются на две части.
Таким образом синтезируются плюс-РНК, которые могут служить матрицами для синтеза вирусных белков и вирусных минус-РНК.
Дальше все просто: глупая клетка на собственных рибосомах из собственных аминокислот синтезирует белки вируса, в том числе РНК-зависимую РНК-полимеразу. Внутри ядра так же бодро производятся минус-РНК гриппа. Сборка вирусных частиц происходит в цитоплазме, на внутренней поверхности клеточной мембраны. Готовый вирус выходит из клетки путем экзоцитоза (почкования), нейраминидаза перекусывает последнюю ниточку, которая соединяет клетку и новорожденный вирус… Новая (злая) маленькая жизнь выходит в мир!
рис. 4
Являются внутриклеточными облигатными паразитами, а это означает, что они не могут реплицировать или передавать свои гены без помощи . Единственная вирусная частица (вирион) сама по себе является инертной. Когда вирус заражает клетку, он использует , ферменты и основную часть клеточной структуры для репликации.
В отличие от того, что мы наблюдаем при процессах клеточного деления, таких как и , репликация вируса дает много потомства, которое разрушает клетку-хозяина, а затем заражает другие клетки в организме.
Вирусный генетический материал
Вирусы могут содержать одноцепочечную/двухцепочечную ДНК или РНК. Тип генетического материала, обнаруженного в конкретном вирусе, зависит от его природы и функций. Точная природа того, что происходит после заражения хозяина, варьируется в зависимости от характера вируса.
Процесс репликации у вирусов с двухцепочечной ДНК, одноцепочечной ДНК, двухцепочечной РНК и одноцепочечной РНК будет отличаться. Например, двухцепочечные ДНК-содержащие вирусы обычно должны проникают в клетки-хозяина, прежде чем смогут реплицировать. Однако, одноцепочечные РНК-содержащие вирусы реплицируются главным образом в клетки-хозяина.
Как только вирус заражает хозяина, компоненты вирусного потомства производятся клеточными механизмами, а сборка вирусного капсида является неферментативным процессом. Вирусы обычно могут заражать только ограниченное количество хозяев. Механизм «блокировка и ключ» является наиболее распространенным объяснением этого явления. Некоторые белки на вирусной частице должны соответствовать определенным рецепторным белкам на поверхности клетки конкретного хозяина.
Как вирусы заражают клетки?
Основной процесса инфицирования и репликации вируса происходит в 6 этапов:
- Адсорбция - вирус связывается с клеткой-хозяином.
- Проникновение - вирус вводит свой геном в клетку-хозяина.
- Репликация вирусного генома - вирусный геном реплицируется с использованием клеточной структуры хозяина.
- Сборка - образуются вирусные компоненты и ферменты, которые начинают собираться.
- Созревание - из собранных компонентов развиваются вирусы.
- Выход - новые вирусы вырываются из клетки-хозяина в поисках новых жертв для инфицирования.
Вирусы могут инфицировать любой тип клеток, включая